Руководство покупателя Технология ПЦР
Технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) является основным продуктом бесчисленных исследовательских и испытательных лабораторий в различных областях, включая биомедицину, клиническую диагностику, тестирование пищевой микробиологии и криминалистику. Эта фундаментальная технология использует термоциклирование для облегчения серии реакций, в которых образец ДНК быстро экспоненциально реплицируется для получения миллионов или миллиардов копий последовательности. Приобретая новую систему ПЦР, важно учитывать конечные цели вашего приложения, точность и эффективность оборудования для термоциклирования, а также емкость и гибкость прибора. В этой статье представлен обзор различных опций и функций, доступных для систем ПЦР, которые помогут выбрать подходящую систему для вашего приложения.
1. ПЦР по сравнению с кПЦР по сравнению с кПЦР
Хотя все системы ПЦР реплицируют ДНК с помощью полимеразной цепной реакции, существуют разные методологии, используемые разными системами для достижения конкретных результатов. Среди этих различных методов — стандартная ПЦР, количественная ПЦР (кПЦР) и цифровая ПЦР (дПЦР).
Стандартные машины ПЦР обычно используются для амплификации ДНК для последующего тестирования и использования; в некотором смысле эта технология используется как средство для создания конечного продукта, а не как метод аналитического тестирования. Амплифицированную ДНК можно измерить только после завершения реакции ПЦР, а не в режиме реального времени, поэтому этот метод иногда называют ПЦР конечной точки. Конечный продукт традиционной ПЦР-амплификации обычно используется для последующего клонирования и секвенирования, а также может быть проверен с помощью гель-электрофореза для подтверждения наличия целевых последовательностей и их относительного количества при низком разрешении (на основе интенсивности полосы).
Для более быстрого и точного количественного определения количества целевой последовательности, присутствующей в образце, количественная ПЦР (кПЦР), также известная как ПЦР в реальном времени, использует флуоресцентные зонды в процессе амплификации для контроля количества ДНК, присутствующей после каждого термического цикла. Наблюдая, сколько циклов необходимо для достижения определенного порога интенсивности флуоресценции, аналитик может определить количество ДНК в исходном материале при сравнении результатов со стандартной кривой. КПЦР также может подтвердить наличие или отсутствие целевой последовательности быстрее, чем ПЦР конечной точки, и поэтому используется в диагностических приложениях, таких как обнаружение атипичная пневмония-CoV-2 (с использованием обратной транскрипции для первого преобразования вирусной РНК в кДНК).
Цифровая ПЦР (дПЦР) — еще один количественный метод, в котором реакции ПЦР происходят в тысячах отдельных реакционных камер, а абсолютное количество молекул ДНК в исходном образце можно определить на основе того, сколько реакционных камер дает флуоресцентный сигнал после завершения амплификации. . В отличие от количественной ПЦР, флуоресцентные измерения не выполняются в режиме реального времени, и стандартная кривая не требуется для количественного определения ДНК в образце. Хотя дПЦР обычно имеет ограниченную производительность и более высокую стоимость, чем кПЦР, она более точна, чувствительна и точна в количественном определении ДНК и особенно полезна в таких приложениях, как обнаружение редких мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).
Определение того, следует ли выбрать конечную точку (качественную/полуколичественную) ПЦР по сравнению с количественным методом (кПЦР или дПЦР), относительно просто, когда вы рассматриваете свое приложение, но выбор между кПЦР и дПЦР может быть более нюансированным. КПЦР является высокопроизводительной, рентабельной и достаточно чувствительной для многих приложений, но цПЦР может быть лучшим выбором, если первостепенное значение имеет абсолютная количественная оценка с низкими пределами обнаружения.
2. Важность контроля температуры
Способность термоциклеров точно и эффективно регулировать и контролировать температуру образцов — это то, что обеспечивает успех реакций амплификации и должно быть в центре внимания при выборе любой системы ПЦР. Различные системы могут предлагать различные возможности в отношении скорости изменения температуры, однородности и точности температуры, а также возможности достижения температурных градиентов в термоблоках для оптимизации метода ПЦР.
Скорость линейного изменения относится к скорости изменения температуры между этапами термоциклирования и обычно выражается в градусах Цельсия в секунду (°C/сек) в технических характеристиках прибора. Производители могут предоставлять информацию о максимальных скоростях линейного изменения и средних скоростях линейного изменения, а также различать скорость линейного изменения (нагрев) и скорость линейного изменения (охлаждение) прибора. Как правило, более высокие скорости линейного изменения соответствуют более быстрому времени выполнения, но покупатели должны с осторожностью концентрироваться на максимальных скоростях линейного изменения без изучения других показателей, связанных со скоростью прибора. Прибор может достичь максимальной скорости линейного изменения только в течение короткого промежутка времени, а средняя скорость линейного изменения будет лучше отражать скорость изменения температуры. Хотя характеристики скорости линейного изменения могут дать общее представление о том, насколько быстро могут работать определенные инструменты, когда это возможно,
Точность и однородность температуры также являются ключевыми факторами для успешных реакций, и хотя все термоциклеры предназначены для получения температуры, необходимой для ПЦР, некоторые функции могут обеспечить более высокую степень достоверности, что имеет решающее значение для приложений, в которых образцы могут быть ограничены, а надежные результаты первостепенное значение, например, в клинической диагностике и судебной экспертизе. Точный контроль температуры также имеет решающее значение при использовании машины ПЦР для чувствительных методов, таких как анализ плавления с высоким разрешением (УЧР). Нагретая крышка может обеспечить лучшую однородность температуры по всей пробирке для ПЦР, так как без нагретой крышки образец может испаряться и конденсироваться в верхней части пробирки, где температура ниже. Конструкция термоблока также влияет на контроль температуры; алюминиевые блоки являются наиболее экономичным вариантом, но имеют наименьшую проводимость, это означает, что они будут достигать однородности температуры медленнее и будут иметь более низкую скорость линейного изменения, чем более проводящие блоки. Блоки с серебряным и золотым покрытием дороже, но позволяют передавать тепло быстрее, обеспечивая равномерное распределение температуры по всему блоку.
Для разных мишеней ДНК могут потребоваться разные температуры для достижения наилучших результатов амплификации; например, ГК-богатые последовательности требуют более высоких температур для денатурации. На идеальные температуры отжига также влияет ряд факторов — хотя температуры для этого этапа обычно выбираются на основе температур плавления праймеров, различий в температурах плавления между парами праймеров, а также влияния концентрации реагентов, рН и концентрации соли. сделать оптимизацию температурных условий реакции сложной задачей. Машины для ПЦР с возможностью градиента температуры предназначены для помощи в оптимизации методов ПЦР, позволяя тестировать несколько температур отжига за один прогон. В зависимости от типов и разнообразия образцов, которые вы планируете анализировать с помощью вашего ПЦР-аппарата,
3. Термоблоки
Как уже упоминалось, термоблок, используемый с прибором для ПЦР, может иметь значение в контроле температуры, но конструкция блока — и конструкция прибора для размещения различных блоков — также влияет на производительность, стоимость расходных материалов и гибкость. Типичные блоки имеют 96-луночный или 384-луночный формат, хотя доступны и другие форматы, такие как 48-луночный и 1536-луночный. Большее количество лунок обеспечивает более высокую производительность при меньших объемах реакции, что изначально будет более дорогостоящим, но в конечном итоге снижает цену за реакцию из-за меньшего объема реагента, используемого для каждой лунки. Принимая во внимание, сколько образцов вы будете обрабатывать и как часто вы будете использовать машину, будет зависеть, будет ли термоблок с меньшим или большим числом лунок наиболее практичным и экономически эффективным для вашей лаборатории.
Некоторые инструменты поставляются с фиксированным форматом блоков, в то время как другие позволяют использовать взаимозаменяемые блоки, обеспечивая большую гибкость при переключении между 96- и 384-луночными форматами или между блоками из разных материалов для различных приложений. Некоторые термоциклеры также вмещают несколько блоков в один и тот же прибор, что позволяет одновременно запускать разные протоколы для разных наборов образцов.3 Блоки с «универсальными» размерами еще больше повышают гибкость использования пробирок, стрипов или планшетов для ПЦР разных размеров по мере необходимости. .
Из-за того, что этот компонент играет ключевую роль в контроле температуры, обработке образцов и пропускной способности, при выборе термоциклера следует тщательно рассмотреть варианты термоблока. Для лабораторий с небольшим объемом образцов или для лабораторий, которые регулярно проводят лишь несколько анализов, могут быть достаточными недорогие приборы с фиксированными блоками стандартного 96-луночного формата. Тем не менее, модульные, гибкие инструменты могут быть выгодны для лабораторий с большим количеством протоколов, различными объемами образцов и большим количеством пользователей, использующих один и тот же инструмент для своих собственных анализов, а также для лабораторий, которые могут захотеть расширить свою пропускную способность в будущем.